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Erythropoetin

Erythropoetin (eˌʁʏtʁoˈpo.e.tɪn, von altgriech. ἐρυθρός erythros „rot“ und ποιεῖν poiein „machen“, Synonyme: EPO, Erythropoietin, Epoetin, historisch auch: Hämatopoetin) ist ein Glykoprotein-Hormon, das als Wachstumsfaktor für die Bildung roter Blutkörperchen (Erythrozyten) während der Blutbildung (Hämatopoese) von Bedeutung ist. Erythropoetin zählt damit zu den sogenannten “Erythropoiesis Stimulating Agents” (Kurzform: ESA). Als Therapeutikum wird biotechnologisch hergestelltes Erythropoetin vorwiegend bei der Behandlung der Blutarmut von Dialysepatienten, bei denen die Blutbildung infolge eines Nierenversagens gestört ist, und nach aggressiven Chemotherapiezyklen eingesetzt (ATC-Code B03XA). Daneben erwarb sich EPO durch zahlreiche Dopingskandale insbesondere im Radsport den zweifelhaften Ruf als „Radfahrerdroge“.


Inhaltsverzeichnis

Biosynthese und biologische Funktion

EPO gehört phylogenetisch zu einer Zytokinfamilie, die neben EPO auch Somatropin, Prolaktin, die Interleukine 2–7 sowie die sogenannten „Colony Stimulating Factors“ (G-CSF, M-CSF und GM-CSF) umfasst. Im Menschen wird EPO etwa zu 85-90 % in der Niere durch die Endothelzellen der um die Nierenkanälchen gelegenen Kapillaren und zu 10–15 % auch durch die Hepatozyten der Leber gebildet. Zudem konnte eine Syntheseaktivität im Gehirn, in der Gebärmutter, im Hoden, in der Milz und sogar in Haarfollikel-Zellen [1] nachgewiesen werden.

Das EPO-Gen im Menschen befindet sich auf dem Chromosom 7 (Position 7q21-7q22). Die Synthese wird stimuliert durch eine verminderte Sauerstoffsättigung (Hypoxie) des Blutes. Dies führt zur Translokation der α-Untereinheit des „Hypoxie-induzierten Faktors“ (kurz HIF) vom Zytoplasma in den Zellkern EPO-exprimierender Zellen. Dort bindet HIF-α an die zugehörige β-Untereinheit (HIF-β), wodurch das fertige Heterodimer HIF-1 entsteht. Dieses wiederum bindet nachfolgend an das „cAMP response element-binding protein“ (kurz CREB) und einen weiteren Transkriptionsfaktor (p300). Der daraus resultierende, aus nunmehr drei Elementen bestehende Proteinkomplex leitet dann durch Bindung an die 3'-Flanke des EPO-Gens die Transkription in die zugehörige mRNA ein, deren Konstruktionscode anschließend ribosomal in das Proteingerüst des EPO-Moleküls translatiert wird.

Die Serumkonzentration des Hormons im gesunden Menschen liegt bei bis zu 19 mU/mL. Bei der Erythropoese bindet EPO im Knochenmark an den transmembranen Erythropoetin-Rezeptor der Vorläuferzellen des Typs BFU-E (Erythroid Burst Forming Unit), die zunächst zu den reiferen Vorläuferzellen des Typs CFU-E (Erythroid Colony Forming Unit) und schließlich zu Erythrozyten ausdifferenzieren.

JAK-STAT-Signalweg nach Bindung von EPO an seinen Rezeptor (vereinfachte Darstellung)

Der Rezeptor (EpoR) gehört zur Familie der Zytokin-Rezeptoren, deren strukturelle Gemeinsamkeiten in zwei oder mehr immunglobulin-ähnlichen Domänen, vier gleich angeordneten Cystein-Resten und der extrazellulären Sequenz WSXWS (Trp-Ser-variable Aminosäure-Trp-Ser) bestehen. Die Bindung von EPO führt zu einer Homodimerisierung des Rezeptors, welche wiederum via Transphosphorylierung das rezeptorgekoppelte Enzym Janus Kinase 2 aktiviert. Dabei werden spezifische, intrazellulär rezeptorassoziierte Tyrosin-Reste phosporyliert und dienen hierdurch als Kopplungsstation für das Signaltransduktionsprotein STAT5, wodurch verschiedene Signaltransduktionskaskaden in Gang gesetzt werden. Insgesamt sind daran 94 Proteine beteiligt.

Pro Tag werden circa 200 Milliarden Erythrozyten gebildet. Zusätzlich zur eigentlichen Erythropoese wirkt EPO bei der Differenzierung der Vorläuferzellen als Apoptosehemmer und stimuliert in geringem Maße auch die Bildung von Megakaryozyten. Akute und chronische Insuffizienzen infolge degenerativer Erkrankungen der Niere führen zu verminderten EPO-Bildung und damit zur renalen Anämie.

Die Aufgabe von EPO im Organismus ist nicht allein auf die Bildung neuer Erythrozyten beschränkt. Immuncytochemische Hybridisierungsuntersuchungen haben gezeigt, dass EpoR in den unterschiedlichsten somatischen Zellen zu finden ist. Dazu gehören Neurone, Astrozyten, Mikroglia- und Herzmuskelzellen. EPO/EpoR-Interaktionen wurden in den verschiedensten nicht-blutbildenden Geweben in Zusammenhang mit Zellteilungsvorgängen, Chemotaxis, Angiogenese, Aktivierung intrazellulären Calciums und Apoptosehemmung nachgewiesen. Spezifische EPO-Bindungsstellen wurden in Nervenzellen nachgewiesen, insbesondere auch im Hippocampus, einer Hirnregion, die besonders anfällig für eine durch Sauerstoffmangel verursachte Schädigung ist. In mehreren Tiermodellen des Hirninfarkts und des Sauerstoffmangels konnte ein schützender Effekt von EPO nachgewiesen werden.

Strukturelle Eigenschaften

Schematische Darstellung des EPO-Moleküls
Zuckerseitenketten (Glykosylierungen):
Asn24: N-glycosyliert, tri-antennär, di-sialyliert.
Asn38: N-glycosyliert, tetra-antennär, tetra-sialyliert.
Asn83: N-glycosyliert, tetra-antennär, tri-sialyliert.
Ser126: O-glycosyliert, mono-antennär, di-sialyliert.
Kalottenmodell des EPO-Moleküls

Das EPO-Gen (5,4 kb, 5 Exons und 4 Introns) codiert ein PräPro-EPO-Protein mit 193 Aminosäureresten. Bei der posttranslationalen Modifikation wird N-terminal ein Signalpeptid mit 27 Aminosäureresten sowie C-terminal ein Argininrest durch eine intrazelluläre Carboxypeptidase abgespalten.

Chemisch ist humanes EPO ein saures, unverzweigtes Polypeptid aus 165 Aminosäuren mit einer Molekülmasse von etwa 34 kDa. Die Tertiärstruktur besteht aus vier antiparallelen α-Helices inklusiver benachbarter Schleifen. Der Kohlenhydratanteil, der etwa 40 % der Molekülmasse beträgt, besteht aus einer O-glykosidisch (Ser 126) und drei N-glykosidisch (Asn 24, Asn 38 und Asn 83) gebundenen Zuckerseitenketten. Die Seitenketten ihrerseits setzen sich aus den Monosacchariden Mannose, Galaktose, Fucose, N-Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosamin und N-Acetylneuraminsäure zusammen. Die N-glykosidisch gebundenen Seitenketten besitzen mehrere Verzweigungen, die man auch als “Antennen” bezeichnet. Im Gegensatz zur konstanten Aminosäuresequenz des EPO-Moleküls sind die Zuckerstrukturen variabel. Man spricht in diesem Zusammenhang von der Mikroheterogenität des EPO-Moleküls, die sowohl im natürlichen (nativen) als auch im rekombinanten EPO auftritt. Diese ist einerseits gekennzeichnet durch variable Abfolgen der Monosaccharide in den Zuckerseitenketten, anderseits durch die variable Anzahl der endständigen N-Acetylneuraminsäuren. Diese, auch unter dem Trivialnamen Sialinsäuren bekannt, sind entscheidend für die biologische Aktivität des Glykoproteins: Je höher der Sialylierungsgrad, desto höher sind die Aktivität und die Serumhalbwertszeit des Hormons. Bemerkenswert ist, dass hoch-sialylierte Isoformen in in vitro-Experimenten eine geringere Affinität zum EPO-Rezeptor zeigen. Dies erklärt wiederum, weshalb die asialylierten Isoformen, bei denen die endständigen Sialinsäuren entfernt sind, aufgrund der hohen Rezeptoraffinität unmittelbar in der Leber durch die parenchymalen Zellen (Hepatozyten), die den EPO-Rezeptor tragen, abgereichert werden und somit wirkungslos sind. Funktionale Isoformen werden dagegen nach und nach auch durch andere Körperzellen, die den EPO-Rezeptor tragen, abgebaut. Beim Abbau werden die EPO-Moleküle durch eine rezeptorvermittelte Endocytose in Lysosomen internalisiert und dort zerlegt.

Die Zuckerseitenketten beeinflussen auch die Stabilität des EPO-Moleküls und üben dabei eine Schutzfunktion aus. Deglycosyliertes EPO, das keine Zuckerseitenketten besitzt, ist deutlich empfindlicher gegenüber pH- und temperaturinduzierten Denaturierungen als natürliches, glycosyliertes EPO [2].

Eine optionale Besonderheit des EPO-Moleküls ist die Sulfatierung N-glykosidischer Zuckerseitenketten. Die genaue Funktion der Sulfatierung, die sowohl im nativen als auch im rekombinanten Molekül nachweisbar ist, ist bisher unbekannt.

EPO als Therapeutikum

Forschungsgeschichte

Die Forschungsgeschichte des Erythropoetins ist naturgemäß eng verknüpft mit dem Erkenntnisgewinn über Entstehung und Funktion des Blutes. Schon seit der Frühgeschichte ist die Bedeutung des Blutes für die Vitalität des Menschen bekannt. In vielen Kulturkreisen stand Blut im Zentrum ritueller Zeremonien. Häufig wurde das Blut eines starken Tieres oder eines getöteten Feindes verabreicht, um dessen Kraft und Mut auf den Empfänger zu übertragen. Selbst in der Bibel ist seine Bedeutung niedergeschrieben. Im 3. Buch Mose, Kapitel 17, Vers 11 heißt es: „Denn des Leibes Leben [Seele] ist im Blut (...)“.

Die erste erfolgreiche Bluttransfusion zur Behandlung einer Anämie nahmen Jean-Baptiste Denis (* 1643, † 1704), Leibarzt von Ludwig XIV. und der Chirurg Paul Emmerez († 1690) am 15. Juni 1667 in Paris vor. Sie führten dem Patienten, dessen Zustand sich nach der Transfusion deutlich besserte, das Blut eines Lammes zu. Der englische Gynäkologe und Geburtshelfer James Blundell (* 1791, † 1878) führte 1825 die erste erfolgreiche homologe Transfusion am Menschen durch, bei der eine Patientin mit starken Blutungen das Blut ihres Ehemanns erhielt. Der genaue Hintergrund für die Wirkung ihrer Therapien blieb den behandelnden Ärzten jedoch verborgen. Erst zur Mitte des 19. Jahrhunderts lieferten Felix Hoppe-Seyler mit der Entdeckung des Hämoglobin und Ernst Neumann durch seine Arbeiten über das Knochenmark als Ort der Blutbildung erste fundamentale Erkenntnisse über die Entstehung und die Funktion des Blutes.

1863 erkannte der französische Arzt Denis Jourdanet indirekt den Zusammenhang zwischen erniedrigtem Sauerstoffpartialdruck und Erhöhung der Erythrozytenzahl, als er hämatokritische Untersuchungen an Personen durchführte, die sich längere Zeit in alpinen Höhenlagen aufgehalten hatten. Jourdanet stellte fest, dass das Blut seiner Probanden dickflüssiger war als dasjenige seiner “normalen” Patienten. Den direkten Zusammenhang stellte Friedrich Miescher 1893 her. Miescher beschrieb die Bildung der Erythrozyten als Ergebnis einer verminderten Sauerstoffversorgung des Knochenmarks. Auf dieser Grundlage gab es Bestrebungen, Anämien mittels gezielt induzierten Hypoxien zu therapieren.

Im Jahr 1906 stellten der Franzose Paul Carnot (* 1869, † 1957) und seine Mitarbeiterin Catherine Deflandre erstmals die Hypothese auf, dass ein humoraler Faktor die Blutbildung regele. Ihre Hypothese gründet auf Experimenten, bei denen das Blutserum von Kaninchen, die zuvor durch Aderlass anämisch gemacht wurden, nach Injektion in gesunde Kaninchen bei diesen die Anzahl roter Blutkörperchen deutlich erhöht. Zahlreiche Versuche anderer Forscher, die Ergebnisse von Carnot und Deflandre zu reproduzieren, schlugen fehl. Erst durch die Verwendung von Phenylhydrazin, einer hämolytischen Chemikalie zur Induktion einer Anämie, konnten auch andere Forscher, wie zum Beispiel 1911 Camillo Gibelli von der Universität Genua, in der Versuchsanordnung von Carnot und Deflandre deren Hypothese aufrechterhalten. Weitere Hinweise für die Richtigkeit der Hypothese eines humoralen Faktors lieferten Experimente, bei denen die Blutbildung in normalen Tieren durch Serum von Tieren verstärkt werden konnte, die unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden. Hier konnte insbesondere Georges Sandor (* 1906, † 1997) vom Institut Pasteur in den 1930er Jahren bedeutende Erfolge erzielen. Die beiden finnischen Nephrologen Eva Bonsdorff (* 1918) und Eeva Jalavisto (* 1909, † 1966) gaben schließlich 1948 diesem Faktor den Namen Erythropoetin, kurz EPO.

Als eigentlicher „Entdecker“ gilt gemeinhin Allan Jacob Erslev, der 1953 die ersten fundierten wissenschaftlichen Publikationen veröffentlichte, in denen die Existenz von Erythropoetin zweifelsfrei bewiesen wurde. Zur Schlüsselfigur der weiteren EPO-Forschung wurde jedoch Eugene Goldwasser. 1954 bestätigten er und seine Arbeitsgruppe von der University of Chicago die Arbeiten Erslevs durch eigene Ergebnisse. Goldwasser und sein Mitarbeiter Leon Orris Jacobson konnten zunächst 1957 indirekt nachweisen, dass EPO in der Niere gebildet wird, und 1977 dann erstmals humanes EPO aus dem Urin isolieren. 1983 gelang Fu-Kuen Lin, einem Mitarbeiter bei Amgen, die Identifizierung des humanen EPO-Gens.[3] 1984 berichtete Sylvia Lee-Huang vom New York University Medical Center erstmals von einer erfolgreichen Klonierung und Expression von rekombinantem humanem EPO (rhEPO) in Escherichia coli;[4] die 1985 dann auch in Säugetierzellen gelang.[5] Hierdurch wurde die großtechnische Produktion von rekombinantem EPO in geeigneten Mengen möglich.

Indikationen für die Therapie mit EPO

Von den gegenwärtig klinisch eingesetzten Wachstumsfaktoren besitzt EPO das größte Indikationsspektrum. Die klassische EPO-Therapie zielt darauf ab, die Bildung roter Blutkörperchen bei Patienten mit renaler Anämie, Tumoranämie und Anämien als Folge von Chemotherapien in Gang zu setzen oder zu unterstützen. Zudem gilt mittlerweile als gesichert, dass die Ansprechrate von hypoxischen Tumoren auf eine Radio- oder Chemotherapie durch die Zunahme der Tumoroxygenierung nach EPO-Applikation gesteigert werden kann.

Der molekulare Pathomechanismus einer Tumoranämie, der sich durch die Zugabe von EPO beheben lässt, beruht auf einer gestörten Eisenverwertung. Da diese Mechanismen auch bei chronischen Infektionen (etwa Morbus Crohn, Colitis ulcerosa) oder Sepsis nachweisbar sind, wird der Einsatz von EPO als therapieunterstützende Maßnahme seit einigen Jahren in klinischen Studien untersucht. Ferner werden EPO-Therapieformen beim Fatigue-Syndrom, beim Myelodysplastischen Syndrom, bei der Aplastischen Anämie, Osteomyelofibrose und HIV-Infektionen diskutiert.

Seine zytoprotektiven Eigenschaften in Zellkultur- und Tiermodellen machen EPO zudem zu einem interessanten Kandidaten für die Behandlung von akuten neurologischen Erkrankungen wie beispielsweise dem Schlaganfall, aber auch neurodegenerativen Erkrankungen. Laut einer 2006 veröffentlichten Pilotstudie kann EPO als Zusatztherapeutikum bei der Behandlung von schizophrenen Patienten möglicherweise eine leichte Verbesserung der kognitiven Fähigkeiten bewirken.[6] Die Autoren nehmen an, dass der beobachtete Effekt auf den protektiven Eigenschaften von EPO gegenüber neurodegenerativen Mechanismen beruhen könnte, die Ergebnisse sind jedoch bisher nicht durch weitere Forschungsgruppen bestätigt worden. In einer weiteren, neuropsychologischen Einzelstudie wurden stimmungsaufhellende Effekte bei gleichzeitiger Verbesserung kognitiver Fähigkeiten durch Verabreichung von EPO bei Patienten mit Angstzuständen und Depression beobachtet.[7] Im Mausmodell zeigte EPO eine verzögernde Wirkung bei der Entstehung der Amyotrophen Lateralsklerose (kurz: ALS)[8]. Im Rattenmodell befördert EPO offenbar das axonale Wachstum durchtrennter Nervenfasern [9]. In einer weiteren Pilotstudie wurden erste Erfolge bei der Behandlung der Friedreich-Ataxie erzielt[10]. Hochdosiertes EPO ist offenbar auch hilfreich bei der Symptombehandlung von chronisch fortschreitender Multipler Sklerose [11]. Inzwischen wurde rekombinantes EPO aufgrund seiner anti-inflammatorischen und anti-apoptotischen Eigenschaften auch erfolgreich bei der Therapie der zerebralen Malaria bei Kindern eingesetzt[12].

Die zytoprotektiven Eigenschaften von EPO sind nicht allein auf neuronales Gewebe beschränkt. Auch Herzmuskelzellen sind nach einer Behandlung mit EPO deutlich unempfindlicher gegenüber ansonsten letalen Stressfaktoren, wie sie z.B. bei einem Herzinfarkt durch eine mangelhafte Sauerstoffversorgung (Hypoxie) auftreten. Somit könnte EPO bei entsprechenden Risikopatienten vorbeugend verabreicht werden [13]. Doch auch noch nach Auftreten eines ischämischen Infarktes kann die Anwendung von EPO hilfreich sein, da die Herzmuskelzellen bei der Reperfusion des Organs vor der sonst üblichen weiteren Schädigung bewahrt werden [14].

Das US-amerikanische Unternehmen NeuroDigm hat nach eigenen Angaben in einem Tiermodell zur Untersuchung von chronischen Schmerzen nachweisen können, dass EPO zur Linderung von Allodynien, die beispielsweise über bestimmte Hirnnerven (Nervus accessorius) oder den Ischiasnerv (Nervus ischiadicus) verarbeitet werden, beiträgt (Quelle: Business Wire 2008-02-04 20:18:19).

EPO-Präparate der ersten Generation

Im Gegensatz zum Insulin, das vor der Anwendung rekombinanter Insulinpräparate aus Bauchspeicheldrüsen von Schweinen stammte (siehe Organon), gab es eine solch „archaische“ Herkunft für EPO nicht. Erst durch die Isolierung des EPO-Gens sowie durch seine Klonierung und Expression in Säugerzellen war es mit Hilfe biotechnologischer Herstellungsverfahren möglich, das Hormon in Mengen zu produzieren, die für die Therapie ausreichten.

Das rekombinante Expressionsvehikel für die Produktion der Varianten Epoetin α und β ist jeweils ein genetisch modifizierter Subclon einer Ovarialzelllinie des Chinesischen Streifenhamsters (Cricetulus griseus), eine so genannte CHO-Zelllinie (Chinese Hamster Ovary). Bei der Produktion der Variante Epoetin ω wird eine genetisch modifizierte und subclonierte Zelllinie aus der Niere eines Jungtieres des Syrischen Goldhamsters (Mesocricetus auratus auratus) verwendet (BHK-Zellen, Baby Hamster Kidney).

Alle rekombinanten EPO-Varianten unterscheiden sich vom nativen, endogenen Molekül in der Zusammensetzung der Zuckerstrukturen (Glykosylierungsmuster). Zudem gibt es auch Unterschiede zwischen den rekombinanten Varianten: Epoetin β weist gegenüber Epoetin α eine geringfügig höhere Molekülmasse, ein breiteres Spektrum basischer Isoformen und damit einen niedrigeren Sialylierungsgrad auf. Der Anteil tetra-sialylierter Seitenketten ist bei Epoetin β jedoch mehr als doppelt so hoch wie bei Epoetin α. Nach Desialylierung zeigte Epoetin β im Vergleich zu Epoetin α im Mausmodell eine um 20 Prozent höhere pharmakologische Aktivität. Epoetin ω, bedingt durch die unterschiedliche Expressionszelllinie, unterscheidet sich strukturell von der α- und β-Variante durch die Abfolge der Zuckermonomere sowie durch die Anzahl der Verzweigungen in den Zuckerseitenketten (Antennärität).

EPO-Präparate der nächsten Generation

Der enorme Erfolg der ersten EPO-Präparate hat dazu geführt, dass (wie bei keinem anderen rekombinant hergestellten Wachstumsfaktor) zahlreiche Strategien entwickelt wurden, um die biologische Aktivität des EPO-Moleküls zu steigern, seine Anwendung zu erleichtern und seine Verträglichkeit zu verbessern. Ein Schwerpunkt lag dabei auf Strukturmodifikationen des Ausgangsmoleküls (Stichworte: Protein-Engineering, Proteindesign). Zudem konnten durch neue Erkenntnisse aus der medizinischen Grundlagenforschung neue Therapiefelder abgesteckt werden. Zur jüngsten Entwicklung in diesem Bereich gehören EPO-Analoga (im Englischen auch als „Mimetics“ bezeichnet), gentherapeutische Ansätze zur Steigerung der EPO-Verfügbarkeit im Organismus und Kombipräparate, die zum Beispiel zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen eingesetzt werden sollen.

Modifikationen des EPO-Moleküls

„Natürliche“ EPO-Varianten

EPO-Mimetics

Gentherapie

Induktoren der EPO-Synthese

Chimäre EPO-Proteine und Kombinationstherapien

Nachahmerpräparate (Biogenerika, Biosimilars, Follow-on-Biologicals)

Mit dem Ablauf der Patente für einige Biopharmazeutika (darunter auch EPO) seit 2004 und mit Hilfe der von der EMEA erlassenen Leitlinien für ähnliche biologisch-medizinische Produkte [35] im Allgemeinen und der Leitlinien für ähnliche biologisch-medizinische Produkte, die rekombinantes Erythropoetin enthalten [36] im Speziellen stehen die Generikahersteller in den Startlöchern. In einigen Ländern außerhalb der Europäischen Union sowie in Asien, Afrika und Südamerika sind EPO-Generika (Biosimilars) bereits verfügbar. Vielfach wäre es sinnvoller, von EPO-Plagiaten zu sprechen, da entsprechende EPO-Präparate bereits seit vielen Jahren im Umlauf sind und bei deren Herstellung und Vertrieb auf Patente und Lizenzen nur wenig Rücksicht genommen wurde. In den USA hat Amgen aufgrund der patentrechtlichen Situation gegenwärtig ein exklusives Vertriebsrecht. Richtlinien zur Einführung von Nachahmerpräparaten, wie sie die EMEA erlassen hat, wurden zwar bereits 2003 von der FDA angekündigt, bisher jedoch nicht umgesetzt. Nach gegenwärtigem Stand können US-amerikanische Generikahersteller erst im Jahr 2009 auf entsprechende Regularien hoffen [37]. Innerhalb der EU sind die ersten EPO-Biosimilars im August 2007 zugelassen worden.

Für Nachahmerpräparate hochkomplexer Proteine hat sich bisher kein einheitlicher Begriff durchgesetzt (siehe auch: Biogenerikum). In der wissenschaftlichen Literatur wird jedoch am häufigsten der Begriff Biosimilar verwendet.

Asien

USA, Mittel- und Südamerika

Afrika und Nahost

Europa

Der Fall „Eprex“

Ab 1998 kam es infolge einer Novelle der EMEA zu schweren Nebenwirkungen bei der Anwendung des EPO-Mittels Eprex/Erypo. Auf Veranlassung der EMEA mussten sämtliche humane Proteinbestandteile im Zuge möglicher Kontaminationsrisiken durch HIV beziehungsweise Erreger der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit aus der Formulierung von Arzneimitteln entfernt werden. Der Hersteller Ortho Biotech verwendete daraufhin anstelle von humanem Serumalbumin den Stabilisator Sorbitol 80 (auch als Polysorbat 80 bezeichnet). Die Zugabe von Sorbitol führte fatalerweise zur Bildung von Mizellen. Diese lösten bei mindestens 250 mit Erypo behandelten Patienten Immunreaktionen und eine Erythroblastopenie (engl. Pure Red Cell Aplasia = PRCA) aus. Eine von Johnson & Johnson durchgeführte Studie ergab, dass Sorbitol 80 organische Bestandteile aus den unbeschichteten Gummistopfen der Applikationsspritzen herausgelöst hatte, welche wiederum zur Präzipitation und Mizellbildung des Präparats geführt haben. Dieser Zwischenfall warf weltweit die Frage auf, inwieweit auch veränderte Aminosäuresequenzen, abgewandelte Glykostrukturen oder Verunreinigungen bei der Herstellung therapeutischer Proteine und derer Derivate (zum Beispiel Biosimilars) zu derartigen Nebenwirkungen führen können. Die brasilianische Zulassungsbehörde Agência Nacional de Vigilância Sanitária (kurz: ANVISA) verhängte noch im selben Jahr ein Importverbot zweier EPO-Präparate. Bei einer Studie der Universität Utrecht zu acht Präparaten, die außerhalb der EU und der USA vertrieben werden, wurden gravierende Mängel hinsichtlich Wirksamkeit, Reinheit und Formulierungskonsistenz festgestellt. Deshalb ist davon auszugehen, dass auf Hersteller von Biosimilars zukünftig schärfere Kontrollen im Rahmen klinischer Studien und strengere Regularien zur Markteinführung zukommen.

Darreichungsformen

Die übliche galenische Form der durch zuständige Behörden gegenwärtig zugelassenen EPO-Präparate ist die einer Injektionslösung mit unterschiedlicher Wirkstoffkonzentration (etwa 500 bis 30.000 IE). Neben EPO enthält die Lösung auf der Basis von Wasser für Injektionszwecke zusätzlich Hilfsstoffe (etwa Harnstoff, Polysorbat 20, verschiedene Aminosäuren und Natriumsalze), die der Wirkstoffstabilität dienen. Die Injektionslösungen werden entweder subkutan oder intravenös appliziert. Je nach Applikation, Wirkstoffkonzentration, Indikation und Wirkungsdauer oder Serumhalbwertszeit des Präparats sind mehrere Injektionen pro Woche oder auch nur eine einmalige Injektion pro Monat erforderlich.

An alternativen Darreichungsformen wird insbesondere im Zusammenhang mit der Entwicklung neuer erythropoetischer Medikamente gearbeitet (z. B. intrapulmonale Gabe des EPO-Fc-Präparats der Firma Syntonix und intramuskuläre Gabe des Präparats Repoxygen von Oxford BioMedica, siehe dazu im Kapitel EPO-Präparate der nächsten Generation). Bei den Standardpräparaten (z. B. Procrit von Johnson & Johnson) wurden Formulierungen mit verzögerter Freisetzung untersucht, z. B. über die sogenannte Enkapsulierung in biologisch abbaubaren Mikrosphären[54]. Das Hauptziel dabei war, die Intervalle zwischen den Einzelgaben zu verlängern und die Verträglichkeit zu verbessern. Ein gravierendes Problem der Enkapsulierung ist die Bildung von EPO-Aggregaten, die eine Anwendung am Patienten ausschließt. Ende der 1990er Jahre konnte die US-amerikanische Firma Alkermes dieses Problem durch ihre patentierte ProLease-Technologie umgehen[55]. Jedoch stellen die Mikrosphären mögliche antigene Adjuvantien dar, die beim Patienten unerwünschte Immunreaktionen auslösen können. Dies erklärt möglicherweise, weshalb es bisher nicht zu klinischen Untersuchungen dieser Formulierungen kam.
Auch an oralen Applikationsformen wurde geforscht, bei der das Problem der Säuredenaturierung durch den Magensaft überwunden werden musste. In Kooperation mit Johnson & Johnson arbeitete die britische Firma Provalis (vormals Cortecs International) an oralen Formulierungen. Ergebnisse hierzu wurden jedoch nie veröffentlicht. Mit der Insolvenz von Provalis im Jahr 2006 kamen diese Aktivitäten zum erliegen.

Nebenwirkungen und Kontraindikationen

Da EPO-Rezeptoren auf der Oberfläche verschiedenster Tumorzellen gebildet werden, besteht grundlegend die Möglichkeit, dass die Verabreichung von EPO-Präparaten das Wachstum von Malignomen jeglicher Art stimulieren kann. Zwei kontrollierte klinische Studien, in denen Patienten mit verschiedenen Krebsarten einschließlich Kopf-Hals-Tumoren sowie Brustkrebs mit rekombinantem EPO behandelt wurden, zeigten einen ungeklärten Anstieg der Mortalität[56] [57]. Gute Erfahrungen bestehen bei der Anämiebehandlung von Multiplem Myelom[58], Non-Hodgkin-Lymphom und chronisch lymphatischer Leukämie[59]. Aufgrund der Nebenwirkungsweise ist bei hypertonischen Patienten besondere Vorsicht geboten. Missbrauch von Gesunden (etwa für Dopingzwecke) kann zu einem übermässigen Anstieg des Hämatokritwertes führen. Dies ist mit dem Risiko lebensbedrohlicher Komplikationen des Herz-Kreislauf-Systems (Thromboserisiko durch Hämokonzentration bei Polyglobulie) verbunden.
Im Frühjahr 2007 veröffentlichte die US-amerikanische Arzneimittelzulassungsbehörde FDA einen Warnhinweis zur Anwendung erythropoese-stimulierender Substanzen infolge der Ergebnisse aus vier klinischen Studien[60] [61] [62] [63], bei denen es in bisher ungeprüften Behandlungsregimen zu lebensbedrohliche Nebenwirkungen kam. Hämoglobin-Level über 12 g/dL, die mittels EPO-Präparaten bei den betroffenen Patienten eingestellt wurden, führten zu einem signifikanten Anstieg der Mortalitätsrate. Aufgrund dessen verordnete die FDA die Abänderung der bisherigen Warnhinweise auf den Beipackzetteln der Präparate Aranesp, Epogen und Procrit[64].
In einer weiteren Multicenter-Studie zum Einsatz von Epoetin β bei einer Anämie von Brustkrebspatienten, die sich einer Chemotherapie unterzogen, konnte dagegen kein Anstieg der Mortalität festgestellt werden[65]. In dieser Studie wurde sogar bereits dann EPO verabreicht, wenn der Hämoglobin-Spiegel unter 12.9 g/dL fiel. Offenbar ist die Sterblichkeit bei einer EPO-Therapie damit nicht unmittelbar abhängig vom eingestellten Hämoglobin-Level. Vielmehr nimmt sie bei Krebspatienten dann zu, wenn diese keine Chemotherapie erhalten.
Das Risiko von Krebspatienten bei einer EPO-Therapie ist nicht allein auf eine Tumorprogression, die durch EPO hervorgerufen werden kann, beschränkt. So steigt auch das Risiko venöser Thromboembolien bei einer EPO-Therapie von Patienten mit soliden Tumoren signifikant an[66].


Weltweite Marktdaten der gängigsten EPO-Präparate (Stand: Januar 2008)

Marktdaten für EPO-Präparate

Als Therapeutikum rangiert EPO unter den zehn weltweit erfolgreichsten Medikamenten überhaupt, unter den Biopharmazeutika ist es der herausragende Blockbuster. Eprex/Procrit von Johnson & Johnson erzielte im Jahr 2004 3,6 Milliarden US-Dollar, Amgens Epogen 2,6 Milliarden Dollar und Roches NeoRecormon 1,7 Milliarden Dollar (Quelle: Chemical & Engineering News Nr. 83). Aranesp, das erste zugelassene EPO-Präparat der nächsten Generation, hat seit seiner Therapieeinführung eine durchschnittliche Zuwachsrate von rund 800 Millionen Dollar pro Jahr und wird die Umsatzzahlen der bisherigen Standardpräparate im Jahr 2007 voraussichtlich übertreffen. Nach einer neuen Veröffentlichung lag Amgens Umsatz mit Aranesp 2006 bei 4,1 Milliarden US-Dollar[67]. Bei den Nachfolgepräparaten Mircera und DynEpo wird mit anfänglichen Umsatzraten von 300 Millionen Dollar (DynEpo) oder 900 Millionen Dollar (Mircera) gerechnet. Der weltweite Bedarf an EPO zu Therapiezwecken ist bei weitem nicht gedeckt. Nach Schätzungen von Marktanalysten werden Hersteller von EPO-Präparaten im Jahr 2010, aufgrund zunehmender Indikationen und trotz der Einführung von Nachahmerpräparaten, insgesamt bis zu 17 Milliarden Dollar erwirtschaften (Quelle: Piribo – Online Business Intelligence for the BioPharma Industry, Feb. 2005: Therapeutic Proteins, Strategic Report, Visiongain). Weltweit erhalten circa 350.000 Patienten rekombinantes EPO (Stand: 1999[68]). Da sich die Umsatzzahlen der EPO-Präparate zwischen 1999 und 2005 mehr als verdreifacht haben[69] , dürfte die Zahl der mit EPO behandelten Patienten entsprechend gestiegen sein.

EPO-Doping

Je mehr rote Blutkörperchen dem menschlichen Blutkreislauf zur Verfügung stehen, desto leistungsfähiger arbeitet der gesamte Organismus, weil den Zellen entsprechend viel Sauerstoff zur Verfügung steht. Aus diesem Grund wird EPO bereits etwa seit Ende der 1980er Jahre zum Zweck der Leistungssteigerung missbraucht. Vor allem Ausdauersportler profitieren von der Wirkung; durch den erhöhten Anteil an Erythrozyten im Blut steigt allerdings die Gefahr von Blutgerinnseln. EPO (und in der Folge auch alle weiteren Derivate wie zum Beispiel Darbepoetin) steht seit 1990 auf der Dopingliste der internationalen Anti-Doping-Organisation (WADA), der Einsatz ist also im Wettkampfsport verboten. Ein praktikables Nachweisverfahren von nicht körpereigenem EPO kann seit 2000 auch bei Urinproben angewandt werden (s. u.).

Nach Berechnungen des italienischen Sportwissenschaftlers Prof. Alessandro Donati dopen sich weltweit 500.000 Menschen mit EPO. Gemäß den Untersuchungen Donatis übersteigt die jährlich produzierte Menge an EPO den tatsächlichen therapeutischen Bedarf um das Fünf- bis Sechsfache. [70]

Der Mediziner, Ausdauersportler und Doping-Experte Jürgen Reul unternahm im Sommer 2007 einen weltweit einzigartigen und heftig umstrittenen Selbstversuch. Er fuhr die legendäre Tour de France-Etappe nach L’Alpe d’Huez am 21. Juni im ungedopten Zustand und nochmals am 4. Juli nach einer zweiwöchigen “EPO-Kur”. Ohne die Einnahme von EPO benötigte er für die 21 Serpentinen 70 Minuten, nach erfolgtem EPO-Doping konnte er sich (trotz schlechterer Wetterbedingungen mit Kälte, Regen und Gegenwind) um etwa 5 % auf 66 Minuten verbessern. Reul beschreibt in einem Interview mit dem Sport-Informations-Dienst (sid) auch die psychische Wirkung der EPO-Einnahme, die in einer (so wörtlich:) „höheren Kampfmoral und unterschwelligen Aggressionen“ bestand.


EPO-Dopingfälle im Profisport

Radsport

Leichtathletik

Wintersport

Fußball

Nachweisverfahren

EPO kann erst seit 2000 durch ein mehrstufiges Verfahren, das durch Françoise Lasne und Jacques de Ceaurriz vom Laboratoire national de détection du dopage (LNDD) entwickelt wurde, im Urin nachgewiesen werden. Dies gelingt auch in geringen Konzentrationen.

Glykosylierungen von Proteinen erfolgen speziesspezifisch, das heißt, das Glykosylierungsmuster von humanem EPO unterscheidet sich vom rekombinanten EPO anderer Spezies. Rekombinantes EPO wird gegenwärtig mit Hilfe transformierter Zelllinien unterschiedlicher Gattungen des Hamsters erzeugt (vgl. Abschnitt EPO als Therapeutikum). Beim rekombinanten EPO ist die Neuraminsäure zu etwa 95 % an Stickstoff acetyliert, etwa 2 % liegen als Glykolylacetyl-Derivat vor. Der Grad dieser unterschiedlichen Acetylierung sowie die An- und Abwesenheit sogenannter Repeats (immer wiederkehrende Zuckereinheiten) sind verantwortlich für unterschiedliche isoelektrische Punkte (pI) von humanem und rekombinantem EPO. Diese Eigenschaft wird analytisch bei der Isoelektrischen Fokussierung (IEF) zum EPO-Nachweis ausgenutzt.

Schritt 1: Mikro- und Ultrafiltration

Im ersten Schritt werden zunächst die im Urin enthaltenen Proteine durch Mikro- und Ultrafiltration von unlöslichen Partikeln befreit und konzentriert.

Schritt 2: Isoelektrische Fokussierung

Im zweiten Schritt erfolgt die Trennung zwischen humanem und rekombinantem EPO sowie der anderen enthaltenen Proteine mittels isoelektrischer Fokussierung (IEF) in einem Polyacrylamid-Gel mit geeignetem pH-Gradienten.

Schritt 3: Immunoblotting

Immunoblotting- und Chemoluminiszenzverfahren zum direkten Nachweis von EPO

Im dritten Schritt erfolgt der eigentliche Nachweis durch ein Immunoblotting, bei dem die im Elektrophoresefeld aufgetrennten EPO-Isoformen auf eine Membran überführt und nachfolgend mit einem EPO-spezifischen monoklonalen Antikörper (mAK) überschichtet werden (Primäres Blotting). Die bindenden mAK werden anschließend im sauren Milieu und durch Anlegen eines elektrischen Feldes dissoziiert und auf eine zweite Membran übertragen. So erhält man ein erneutes Abbild der einzelnen EPO-Banden. Allerdings befinden sich auf der zweiten Membran keine EPO-Moleküle, sondern die spezifischen monoklonalen Antikörper (Sekundäres Blotting). Die Antikörperbanden werden durch einen anti-EPO-mAK spezifischen zweiten Antikörper sichtbar gemacht. Dieser Sekundärantikörper ist an ein Enzym (zum Beispiel Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase (AP)) gekoppelt, welches die Umsetzung eines chromogenen Substrates (zum Beispiel Luminol oder ABTS) katalysiert, das sich mittels Chemolumineszenz quantifizieren lässt.

Diskussionen und Ergänzungen zum Nachweisverfahren

Siehe auch

Literatur

Biosynthese und biologische Funktion

Strukturelle Eigenschaften

Forschungsgeschichte

Indikation für die Therapie mit EPO

EPO-Präparate der ersten Generation

EPO-Präparate der nächsten Generation

Nachahmerpräparate (Biosimilars) / Der Fall „Eprex“

Darreichungsformen

EPO-Doping

Nachweisverfahren

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